Uhrf1依存的ヒストンH3K23のユビキチン化がDNAメチル化維持と複製を共役する

► 論文リンク

DNAメチル化は主にプロモータにおいてCpG（シトシン−グアニン）配列の両方の鎖のシトシンに起こり、遺伝子発現の抑制と相関し、メチル化はDNA複製と細胞分裂を繰り返しても維持されている。DNAメチル化維持は、遺伝子発現制御、インプリンティング、X染色体不活化など、エピジェネティクスの維持継承に非常に重要な生物学的意義を持つ。DNA複製直後は、新生鎖に挿入されたシトシンにメチル化はおこっていない状態（ヘミメチル化）であり、これをメチル化するのが、DNAメチル化維持酵素であるDnmt1である。しかし、Dnmt1は単独で機能するのではなく、DNA複製時、これをヘミメチル化DNA部位にリクルートする別の酵素Uhrf1を必要とすることが知られている。Uhrf1はN末から、①ユビキチン様ドメリン、②Tudor-PHD fingerドメイン（ヒストンH3K9メチル化に結合）、③SRAドメイン（メチル化シトシンに結合）、④Ring fingerドメイン（ユビキチンE3酵素として機能）などの興味深いドメインを持っており、その機能の解明は注目を集めている。

今回紹介する論文は、Uhrf1がいかにしてDnmt1をヘミメチル化CpG部位のクロマチンにリクルートするかを検証し、そのメカニズムを明らかにしたものである。Uhrf1の機能を考える上で大変重要と思われるし、後述のように、DNA損傷応答との関連も考えられるので、紹介する。

従来、Uhrf1とDnmt1が物理的に直接相互作用することで、Uhrf1がDnmt1をリクルートするという報告がある。しかし、著者等が検証してみたところ、相互作用を認める事ができなかった。そこで、いかにUhrf1がDnm1を制御するのかを明らかにするため、彼らは、アフリカツメガエルの卵抽出液を用意し、精子DNAを加えてDNA複製時にDNAメチル化を再現する系を構築した。この系で、ビーズに結合させた抗体を使用してUhrf1を除去したところ（immunodepletion）、Dnmt1のクロマチン結合が検出できなくなった。これは、従来の報告に一致した所見である。つぎに、Dnmt1を除去した抽出液でクロマチンにおける各種蛋白質をウェスタンで調べたところ、Uhrf1量にはっきりとした増加をみとめ、さらにヒストンH３のバンドがラダー状にシフトしていることを見いだした。このラダーはUhrf1に依存的であり、ユビキチン抗体でも検出されたため、ヒストンH3がUhrf1によってユビキチン化されたものと考えられた。この発見が今回の論文の核となっている。実際、この修飾は、マススペクトロメトリーでH3の２３番目のアミノ酸残基リジンのユビキチンである事が確認された。さらに、Dnmt1を免疫除去した抽出液に、リコンビナントの野生型と酵素活性欠失型のマウスDnmt1をそれぞれ加えて戻し実験を行うと、野生型ではDnmt1のクロマチン結合は一過性であったが、酵素欠失型では複製開始後3時間でクロマチン結合したままであり、しかもH3のユビキチン化も失われていなかった。したがって、H3の脱ユビキチン化とDnmt1のクロマチンからの放出が、何らかのメカニズムで共役しているようである。

以上の結果は、Dnmt1がユビキチン化ヒストンH3に結合して、クロマチンにリクルートされることを示唆している。実際、Dnmt1除去卵抽出液からH3を免疫沈降して、ユビキチン化されたH3を用意し、何も除去していない卵抽出液や、リコンビナントDnmt1をまぜてやると、ユビキチン化H3とDnmt1との会合が検出された。また、far western法でユビキチン化H３とDnmt1の会合を検出しており、この会合が直接であることを示唆している。また、従来Dnmt1の複製部位へのリクルートに必要とされたDnmt1のN末部分が、ユビキチン化H３との会合に必要であることも示している。

さらに、ヒト細胞HeLaでも、shRNAを使用したノックダウンの系で、カエル卵抽出液と同様の現象が見られる事を確認した。また、野生型とK23Rの変異型ヒストンH3をHeLaに導入し、Dnmt1ノックダウン時のユビキチン化がS期でK23におこる事を認めている。

Uhrf1のユビキチン化活性やクロマチン結合がDnmt1の制御にどのように機能しているのだろうか。著者らは、HeLa細胞を使用し、Uhrf1のノックダウンと野生型、Ring変異型、SRA変異型の3種のUhrf1発現ベクター導入により、Uhrf1を変異型に入れ替えた。結果は、Dnmt1ノックダウンによるH3ユビキチン化に、RingとSRA両方のドメインが必要であることが明らかとなった。さらに、Dnmt1とUhrf1の核内局在を調べると、既報どおり両者は複製フォーカスで共局在しているが、Ring変異型Uhrf1はフォーカスになるが、そのときDnmt1はフォーカスにならないこと、さらに、SRA変異型Uhrf1においては、自身もDnmt1もフォーカス形成させる能力がないことが明らかとなった。これらの結果と一致して、いくつかのローカスでDNAメチル化の維持が、Uhrf1の両方の変異型発現細胞では失われていた。

サプルメントデータは、例によって膨大だが、メインストーリーは簡潔で、基本的に非常にconvincingなデータでまとめられている。生物学的に非常に重要な問題に、ヒストンH３の新規ユビキチン化という発見で解答を与えた重要な論文と高く評価されたものと考える。あと残されたポイントとしては、上記のように、Dnmt1がおそらくメチル化後クロマチンからリリースされるとき、H3の脱ユビキチン化が同時？に共役しておこっている。これに機能する脱ユビキチン化酵素については、この論文ではっきりとは同定されてないが、サプルメントに抗体によって精製されたDnmt1複合体によるH3のインビトロ脱ユビキチン化反応が示されている。このメチル化と脱ユビキチン化のカップリングにも面白いメカニズムがありそうで、大変興味深い。

さて、このUhrf1を最初にクローニングしてNp95と名付けて報告したのは、藤森博士ら放医研のグループであり1)、さらに武藤博士らがノックアウトのES細胞を作製し、放射線など様々なDNA損傷に感受性になることを明らかにしている2)。DNAメチル化維持に必須なUhrf1のDNA損傷応答における役割は、DNAメチル化やクロマチン制御と関係があるのか。あるいは、全く関係ないメカニズムが隠されているのだろうか。

紹介者：京都大学　放射線生物研究センター　高田　穣

1. Cloning and mapping of Np95 gene which encodes a novel nuclear protein associated with cell proliferation.　Fujimori A, Matsuda Y, Takemoto Y, Hashimoto Y, Kubo E, Araki R, Fukumura R, Mita K, Tatsumi K, Muto M.　Mamm Genome. 1998 Dec;9(12):1032-5.

2. Targeted disruption of Np95 gene renders murine embryonic stem cells hypersensitive to DNA damaging agents and DNA replication blocks. Muto M, Kanari Y, Kubo E, Takabe T, Kurihara T, Fujimori A, Tatsumi K. J Biol Chem. 2002 Sep 13;277(37):34549-55.