ヒト大脳皮質オルガノイドにおける放射線誘発神経障害と障害軽減効果の時間的解析

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【背景・目的】
放射線治療は、原発性・転移性脳腫瘍を含む中枢神経系（central nervous system：CNS）悪性腫瘍の重要な治療法の1つである。一方、治療効果の向上に伴い、周囲の正常脳組織に生じる放射線障害、とくに長期的な認知機能低下が問題となっている。放射線誘発脳障害には、神経幹・前駆細胞の減少、神経新生の障害、反応性グリオーシス、神経炎症、シナプス機能障害などが関与すると考えられている。これまでの研究には主として動物モデルや二次元培養系が用いられてきたが、ヒト脳に特有の発生過程や三次元構造、複数の神経系細胞間の相互作用を十分に再現できないという課題がある。
本論文では、ヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPSC）由来大脳皮質オルガノイドを用いて、単回照射および臨床的な分割照射を模した2 Gy×5回照射後の急性・遅発性変化を解析した。さらに、放射線障害軽減薬の候補物質を照射後に投与し、ヒト大脳皮質オルガノイドをCNS放射線障害および治療候補薬の評価系として利用できるかを検討した。

【主な結果】
著者らは複数のヒトiPSC株を用いて、胚様体形成後に神経誘導、大脳皮質への分化および成熟を段階的に促す三次元培養によって大脳皮質オルガノイドを作製した。オルガノイド内には神経幹・前駆細胞、深層および上層大脳皮質ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなどが認められ、大脳皮質様の組織構造が形成されていた。本研究では、神経細胞の成熟およびグリア細胞の発達が進んだ状態で放射線応答を評価するため、培養120日目のオルガノイドを照射実験に用いた。
培養120日目の大脳皮質オルガノイドに対して、線量率5.519 Gy/minのX線を用い、0、2、4、6、8 Gyの単回照射、または1日2 Gyを5日間連続して照射する分割照射を行った。非照射群として比較したところ、照射後には線量依存的なオルガノイド径の低下が認められた。一方、2 Gyおよび4 Gyの単回照射群や分割照射群ではその後再びサイズが増加しており、初期の細胞障害後にも組織の回復・再増大が生じることが示唆された。DNA二本鎖切断の指標であるγH2AXは照射30分後に増加し、72時間後には大部分が低下した。また、また、照射72時間後にはcleaved caspase-3陽性細胞が線量依存的に増加し、特に6 Gyおよび8 Gyの単回照射群で顕著であった。一方、2 Gy×5回の分割照射群では、6 Gy単回照射群と比較してcleaved caspase-3陽性細胞が少なかった。ただし、Nestin陽性細胞とcleaved caspase-3の明瞭な共局在は認められず、前駆細胞減少の機序については、より早期の細胞死や自己複製能の低下など複数の可能性が考えられる。
単回照射および分割照射後72時間、2週間、4週間で遺伝子発現を解析したところ、Nestin、SOX2、PAX6などの神経幹・前駆細胞マーカーが低下する一方、GFAP、S100β、vimentinなどのグリア系マーカーが増加した。また、大脳皮質層構造に関連するマーカーでは、深層ニューロンマーカーであるTBR1およびCTIP2の発現が増加した一方、上層ニューロンマーカーであるSATB2の発現は減少した。著者らは、これらの結果から、放射線が細胞死を誘発するだけでなく、神経系細胞の分化状態や細胞系譜のバランスにも影響すると考察している。とくに、2 Gy×5回の分割照射では、単回高線量照射と比較して神経幹・前駆細胞や神経分化マーカーが比較的保たれ、Synapsin 1などのシナプス関連マーカーの低下も軽度であり、単回照射と分割照射では三次元組織としての応答が異なることが示された。これは、修復や細胞集団の変化、組織再構築を含む時間依存的な放射線応答を、ヒト由来オルガノイドで解析できる可能性を示す結果である。
single-cell RNA sequencingでは、分割照射後に増殖性細胞およびdividing radial gliaが著しく減少し、細胞老化に関連する転写シグネチャーも上昇した。また、神経分化・成熟に関連する細胞状態の変化が認められ、放射線がオルガノイド内の複数の細胞集団に異なる影響を与えることが示された。
最後に、放射線障害軽減薬の評価系としての応用可能性を検討するため、著者らの先行研究で放射線障害軽減作用が示された2種類の候補化合物を評価した。NSPPはSonic Hedgehog（Shh）シグナル伝達経路に関与するSmoothened受容体の作動薬であり、amisulprideはドーパミンD2/D3受容体の拮抗薬である。オルガノイドに8 GyのX線を単回照射し、24時間後からNSPPまたはamisulprideを10µM投与した。その結果、放射線によるオルガノイドの成長低下や神経系マーカーの低下が部分的に軽減され、GFAPやTNF-α、IL-1β、CCL2などの炎症関連マーカーの増加も抑制された。これらの結果から、ヒト大脳皮質オルガノイドが、照射後に投与する放射線障害軽減薬の評価系として利用できる可能性が示された。

【考察・まとめ】
著者らは、本研究で用いたヒトiPSC由来大脳皮質オルガノイドが、DNA損傷や細胞死に加えて、神経幹・前駆細胞、神経・グリア系譜、シナプス、炎症関連応答の変化を三次元組織内で経時的に解析できるモデルであると考察している。とくに、分割照射に対する応答が単回照射とは異なることや、照射後の薬剤投与による障害軽減効果を評価できた点から、CNS放射線障害の解析や候補薬の前臨床評価への応用可能性を示している。
一方、本モデルは成人脳を完全に再現するものではなく、発達期脳に近い性質を残している。また、機能的血管網、血液脳関門様構造、ミクログリアを欠くため、血管障害やミクログリア依存性神経炎症を十分に評価できない。著者らも、今後は血管化オルガノイドやミクログリアを含むオルガノイド、電気生理学的機能評価、in vivoモデルとの比較が必要としている。
これらの限界はあるものの、ヒト由来の複数細胞系譜を含む三次元組織において、分割照射後の時間依存的な正常組織応答とその軽減効果を解析できる点は本研究の大きな特徴である。今後、より生理学的なオルガノイドモデルへ発展することで、正常組織の放射線感受性や放射線治療における知見の提供、さらには放射線障害軽減薬の開発に貢献することが期待される。